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Tag: Proteine

AlphaFold – Was kann die “Wunder-KI” wirklich?

Vor einigen Tagen wurde AlphaFold 3 veröffentlicht, ein KI-Werkzeug zur Vorhersage von Proteinstrukturen. Die Zeit schreibt dazu „Eine KI die wirklich hilft“ oder „KI sagt Struktur aller Moleküle des Lebens voraus“, der Standard nennt es die “Wunder-KI“. Auch in der Wissenschaft ist das Lob für die Fähigkeiten von AlphaFold groß, es gibt jedoch auch einige skeptische Stimmen.

Aber was ist AlphaFold eigentlich genau, was bringt es und was kann es wirklich? Darauf werde ich in diesem Text einen kritischen Blick werfen.

Wieso sind Proteinstrukturen so wichtig?

Eins erstmal vorneweg: AlphaFold und andere KIs zur Vorhersage von Proteinstrukturen sind extrem beeindruckend. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen ist kompliziert, und eine Möglichkeit, sie verlässlich vorherzusagen, war lange ein unerfüllbarer Traum. Aber wie verlässlich sind diese KIs wirklich? Wie funktioniert das? Und vor allem, für was brauchen wir diese Proteinstrukturen überhaupt?

Beschäftigen wir uns zuerst mit der letzten dieser Fragen: Wofür brauchen wir die Struktur von Proteinen? Im Prinzip ist es ganz einfach, denn die Struktur bestimmt bei Proteinen zum Großteil die Funktion.

Proteine bestehen aus Aminosäuren, die eine hinter der anderen aufgereiht sind. Davon gibt es – mit ein paar Ausnahmen – 20 Stück. Würden die alle nur in einer langen Kette aneinander hängen, wären die möglichen Fähigkeiten von Proteinen sehr begrenzt. Wenn wir uns aber echte Proteine anschauen, können die jedoch sehr, sehr viel. Sie können als Enzyme biochemische Reaktionen katalysieren, sie können als Rezeptoren Botenstoffe erkennen, sie können als Transporter Stoffe über Zellmembranen transportieren und sie können Festigkeit und Halt geben – denkt da nur an eure Nägel.

Diese Fähigkeiten von Proteinen entstehen dadurch, dass ihre 3D-Struktur die richtigen Aminosäuren an die richtige Stelle bringt. Dort können sie dann miteinander und ihrer Umgebung interagieren und beispielsweise eine Bindetasche für andere Moleküle bilden.

Wenn wir also verstehen wollen, wie Proteine funktionieren – und das müssen wir vor allem auch, weil darauf die meisten unserer Arzneimittel basieren – müssen wir ihre Struktur verstehen.

Was ist AlphaFold 3?

Kommen wir jetzt zum „Star“ dieses Textes – AlphaFold. AlphaFold ist ein KI-Werkzeug zur a priori Vorhersage von Proteinstrukturen (seit AlphaFold 3 werden aber auch andere Biomoleküle wie z.B. DNA besser unterstützt). Aus der Aminosäure-Sequenz eines beliebigen Proteins kann also dessen Struktur vorhergesagt werden.

Überlagerung einer experimentellen Struktur (blau) des Proteins Albumin und Vorhersage von AlphaFold3 (gelb). Vorhersage und experimentelle Struktur stimmen ziemlich gut überein. (Struktur: PDB 1AO6, 10.1093/protein/12.6.439)

Diese Struktur kann dann zum Beispiel zur Entwicklung neuer Arzneistoffe verwendet werden. Denn gerade dafür braucht man oft ein genaues Bild davon, wie der Wirkstoff an das Protein bindet und mit welchen Aminosäuren er dort interagiert. Und man muss wirklich zugeben, dass AlphaFold erstaunlich gut ist. Wie schon gesagt ist die dreidimensionale Struktur von Proteinen eine komplizierte Angelegenheit und bei vielen Proteinen stimmen die Vorhersage und die experimentell bestimmte Struktur sehr gut überein. Allerdings ist AlphaFold lange nicht perfekt, auch nicht seit AlphaFold 3. Genauso wie es bestimmte Stärken hat, hat es auch Schwächen, die meiner Einschätzung nach sehr schwierig zu überwinden sein werden. Vieles davon wird in diesem Paper von 2023 schön zusammengefasst.

Unerwartetes entdecken

Einer der Hauptgründe, weshalb AlphaFold so gut ist, ist die Qualität der Trainingsdaten. Wie ChatGPT zum Beispiel ist AlphaFold auch ein sogenanntes large language model, also eigentlich ein Sprachmodell. Nur ist die Sprache, die AlphaFold spricht, eben keine Menschliche, sondern die „Sprache“ der Aminosäuren. Aber genau wie bei ChatGPT, das mit einer Unzahl von Texten trainiert wurde, braucht auch AlphaFold Trainingsdaten. Und hier hatten die Entwickler:innen enormes Glück, denn es existieren sehr viele, sehr gute experimentell bestimmte Proteinstrukturen, die frei zugänglich sind. Ohne diese Daten, die in Jahrzehnten strukturbiologischer Arbeit gewonnen wurden, wäre AlphaFold nicht möglich gewesen.

Das führt allerdings auch dazu, dass AlphaFold Schwierigkeiten damit hat, Unbekanntes oder Unerwartetes zu entdecken – es funktioniert ja auch durch den Vergleich mit bekannten Strukturen. Eine der großen Stärken experimenteller Methoden, solche unerwarteten Strukturmotive, Cofaktoren, Ionen oder Modifikationen zu entdecken ist damit eine der Schwächen AlphaFolds. Und die eigentlich unerwarteten Dinge sind eben oftmals die interessantesten.

Flexible Proteine sind ein Problem

Besonders gut sind die Vorhersagen von AlphaFold bei Proteinen (oder Teilen von Proteinen), die eine sehr stabile und gut definierte Struktur haben – so wie Helices und β-Faltblätter, für diejenigen von euch, die sich auskennen. Aber 30 % aller (eukaryotischer) Proteine besitzen Regionen, die man als intrinsically disordered bezeichnet und die im Prinzip gar keine festgelegte Struktur besitzen. Einige Protein sind sogar komplett intrinsically disordered und besitzen kaum stabile Strukturmotive. Solche flexiblen Proteine und Regionen bereiten der Strukturbiologie seit jeher Probleme, sei es experimentell oder via KI.

Vorhersage der Struktur des M2-Acetylcholinrezeptors. Die Farben stellen die Zuverlässigkeit der Vorhersage dar: blau – sehr hoch, hellblau – hoch, gelb – niedrig, orange – sehr niedrig. Die Zuverlässigkeit ist vor allem in gut strukturierten Bereichen hoch, während sie in flexiblen Bereichen niedrig bis sehr niedrig ist.

Es ist aber auch möglich, dass sich aus einer flexiblen Region kurzzeitig eine stabile Konformation (so werden definierte Proteinstrukturen auch bezeichnet) ergibt. Solche induzierten Konformationen entstehen häufig durch Wechselwirkungen mit z.B. anderen Proteinen. AlphaFold trifft seine Vorhersagen rein aus der Aminosäuresequenz eines Proteins und „weiß“ nichts über dessen physikochemische Eigenschaften. Es kann also auch nicht vorhersagen, welche Auswirkungen solche Wechselwirkungen auf die Struktur eines Proteins haben und erkennt die induzierte Konformation möglicherweise nicht.

Proteine sind ständig in Bewegung

Worauf physikochemische Wechselwirkungen noch einen großen Einfluss haben ist die Bewegung – die Dynamik – eines Proteins. AlphaFold liefert statische Bilder einer Proteinstruktur, aber eigentlich sind Proteine ständig in Bewegung und wechseln zwischen unterschiedlichen Konformationen hin und her. Das ist zum Beispiel der Fall, wenn ein Signalmolekül an ein Rezeptorprotein bindet; um dieses Signal weiterzuleiten muss der Rezeptor seine Struktur etwas verändern. Solche Unterschiede zwischen aktiver und inaktiver Form eines Proteins stellen für die Vorhersage der Struktur immer noch ein Problem dar und häufig erhält man eine Mischung aus beiden Möglichkeiten.

Überlagerung eines Proteinkomplex aus Vasopressin-Rezeptor 2 und beta-Arrestin 1 – beide Proteine sollten in einer aktiven Konformation sein. Die experimentell bestimmte Rezeptor-Struktur ist blau, die Vorhersage von AlphaFold 3 ist orange. Beide Arrestin-Strukturen sind grau. (Struktur: PDB 7R0C, 10.1126/sciadv.abo7761)

Auch andere Prozesse können dafür sorgen, dass Proteine ihre Struktur verändern. Posttranslationale Modifikationen – das „Dekorieren“ mit bestimmten chemischen Gruppen, nachdem die Aminosäuresequenz fertig ist gehört dazu, oder auch der pH-Wert. In bestimmten Bereichen einer Zelle herrschen andere pH-Werte und beeinflussen das Verhalten von Proteinen. Das kann AlphaFold jedoch auch nicht in jede seiner Vorhersage mit einkalkulieren.

(Not So) Open Science

Eine andere Sache, die ich an AlphaFold bedenklich finde, hat nichts mit dem Programm an sich zu tun, sondern mit den Unternehmen, die dahinter stehen. Wie Retraction Watch berichtet, haben Google und dessen Tochterunternehmen Deep Mind den Code (und die Trainingsdaten) von AlphaFold 3 nicht öffentlich gemacht – nicht einmal den Reviewern des Papers, das über die neue AlphaFold-Version berichtet. Es gibt zwar den AlphaFold-Server, den man für Simulationen mit AlphaFold 3 nutzen kann, allerdings nur für eine begrenzte Zahl an  Aufträgen pro Tag und nicht für alle Vorhersagen, die es kann – oder können sollte.

Das macht es nicht nur unmöglich, die Angaben über die Leistungsfähigkeit des Programms genau zu überprüfen, sondern widerspricht auch den Grundsätzen guter Wissenschaft. Daten und Code sollten für die Wissenschafts-Community zugänglich sein, um die Forschung möglichst weit voran zu bringen und Ergebnisse überprüf- und replizierbar zu machen.

Fazit: Was kann AlphaFold?

Das Ganze liest sich jetzt möglicherweise, als wäre ich kein allzu großer Fan von KI-Werkzeugen zur Vorhersage von Proteinstrukturen. Aber dem ist eigentlich nicht so – man muss sie nur als das betrachten, was sie sind. Nämlich Werkzeuge, mit ihren eigenen Einsatzgebieten, Stärken, Schwächen und Limitationen.

Ich wollte mit diesem Text einen eher kritischen Blick auf AlphaFold und Co. werfen, vor allem nach der extrem lobenden Berichterstattung der letzten Tage. Denn so gut AlphaFold auch ist – und es ist sehr gut – wird es nicht die experimentelle Strukturbiologie überflüssig machen oder uns im Rekordtempo einen neuen Arzneistoff nach dem anderen entwickeln lassen. Tatsächlich funktionieren AlphaFold-Vorhersagen für die Entwicklung neuer Arzneistoffe schlechter als solche, die auf experimentellen Daten basieren.

Stattdessen muss es sinnvoll in Arbeitsabläufe eingebunden werden. Seine Geschwindigkeit und Einfachheit muss verwendet werden, wenn sich aufwändige Experimente nicht lohnen. Experimente hingegen sind immer noch nötig, um neue und unerwartete Dinge zu entdecken – und um Vorhersagen überprüfen zu können. Aber richtig angewendet sind AlphaFold und Co. auf jeden Fall Werkzeuge, die in den Werkzeugkasten der Wissenschaft gehören und die anderen Werkzeuge darin gut ergänzen können.

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Biomolekül des Monats: Häm

Diesen Monat wird es blutig, denn mein Biomolekül ist eines der wichtigsten Moleküle unseres Blutes. Mir ist bewusst, dass es für diesen Titel unglaublich viele Kandidaten gibt. Aber die wohl bekannteste Funktion des Bluts ist es, Sauerstoff zu transportieren; und dafür wird ein Molekül ganz besonders benötigt: Häm.

Und auch wenn Häm allein deshalb schon wortwörtlich lebenswichtig ist, möchte ich euch hier nicht nur zeigen, wie Häm überhaupt Sauerstoff transportieren kann. Ich möchte euch stattdessen auch die anderen wichtigen Funktionen von Häm vorstellen, sowie die Krankheiten, die entstehen, wenn die Biochemie des Häm gestört ist.

Die Basics

Über Häm und die Stoffklasse zu der es gehört – die Porphyrine – gibt es eine Menge zu sagen, und unglücklicherweise ist hier nicht der Ort, um das alles auszuführen. Aber um ein paar der Basics werden wir uns auf jeden Fall kümmern:

Häm ist ein organisches Molekül, das mit vier Stickstoffatomen ein Eisenion in seiner Mitte koordiniert. Mit diesem Eisenion kann es ein Sauerstoff-Molekül binden, und das ist es, was Häm für uns so wichtig macht. Sauerstoff, wenn er von unserem Blut zu allen möglichen Geweben im Körper transportiert wird, liegt an Häm gebunden vor. Das ist die bekannteste und eine wirkliche wichtige Funktion von Häm, aber lange nicht die einzige. Dazu jedoch später mehr.

Struktur von Häm b, der häufigsten Form von Häm beim Menschen

Das Eisen kann in zwei unterschiedlichen Oxidationsstufen vorliegen: Eisen(II) und Eisen(III). Eisen(II) hat nur ein Elektron mehr als Eisen(III), trotzdem ist nur diese Form in der Lage, Sauerstoff zu binden. Ab und zu wird das Eisen(II) im Häm natürlicherweise zu Eisen(III) oxidiert, aber das ist kein Problem. Denn es gibt ein spezielles Enzym (die Methämoglobin-Reduktase), dessen Aufgabe es ist, das Eisen(III) in Hämoglobin (siehe unten) wieder zum Eisen(II) zu umzusetzen. Es gibt aber auch einige Gifte – wie beispielsweise Nitrite – die das Häm-Eisen oxidieren können, wogegen die Methämoglobin-Reduktase dann nicht mehr ankommt.

Häm in Hämoglobin und darüber hinaus

Eine sehr wichtige Sache habe ich aber bis jetzt verschwiegen. Denn das Häm kann seine Aufgaben nicht allein erfüllen. Es ist eine sogenannte prosthetische Gruppe – ein Molekül, das mit einem Protein verbunden ist, aber nicht selbst aus Aminosäuren besteht. Daher braucht das Häm ein Protein, um zu funktionieren, um im Gegenzug braucht das entsprechende Protein das Häm.

Und noch etwas habe ich bisher verschwiegen: Es gibt auch verschiedene Arten von Häm. Wenn wir also wissen wollen, welche Aufgaben Häm im menschlichen Körper hat, müssen wir uns anschauen, welche Arten von Häm in welchen Proteinen vorkommen.

Fangen wir wieder mit dem Klassiker an: Häm b (auch Fe-Protoporphyrin IX genannt) und Hämoglobin. Hämoglobin ist das Protein, das in Erythrozyten – den roten Blutzellen – vorkommt und für den Sauerstofftransport verantwortlich ist (und zusätzlich dem Blut die rote Farbe verleiht). Es besitzt vier Häm-Gruppen und eine ganz interessante Eigenheit, den kooperativen Effekt. Die vier Häm-Gruppen binden Sauerstoff nicht unabhängig voneinander. Stattdessen wird, wenn eine der Häm-Gruppen ein Sauerstoff-Molekül gebunden hat, die Bindung von Sauerstoff an die anderen Häm-Gruppen stark begünstigt. Und umgekehrt werden, wenn das mit Sauerstoff beladene Hämoglobin ein Sauerstoff-Molekül abgibt, auch die anderen drei Sauerstoff-Moleküle leichter abgegeben. Das ist nötig, damit das Hämoglobin in der Lunge zwar vollständig mit Sauerstoff beladen werden, es diesen Sauerstoff in den anderen Geweben dann aber auch effektiv wieder abgeben kann.

Die Bewegung von Hämoglobin, wenn Sauerstoff (hellblau) an die Hämgruppe (rot) des Hämoglobins bindet, ermöglicht des kooperativen Effekt (Bild: Shuchismita Dutta, David Goodsell, DOI 10.2210/rcsb_pdb/mom_2003_5)

Häm b kommt außerdem noch in Myoglobin vor. Myoglobin besitzt eine Häm-Gruppe und ist ebenfalls für den Sauerstofftransport zuständig. Allerdings nicht im Blut, sondern innerhalb von Muskeln.

Auch eine ganze Menge von Enzymen brauchen Häm b, um ihre Aufgaben zu erfüllen. Dazu gehören beispielsweise Enzyme aus dem Energiestoffwechsel, mit denen wir aus Nährstoffen Energie gewinnen können. Außerdem ist eine extrem große Enzym-Familie – die CYP-Enzyme – Häm-abhängig. Sie verstoffwechseln sowohl körpereigene als auch Fremdstoffe und sind außerdem an der Herstellung wichtiger Botenstoffe wie der Steroidhormone beteiligt. An dieser Stelle muss ich eine weitere Vereinfachung gestehen, die ich weiter oben getroffen habe. Denn im Zuge des (sehr spannenden) Mechanismus von CYP-Enzymen liegt das Eisen nicht nur in den Oxidationsstufen II und III vor, sondern auch in den Stufen IV und V.

Kristallstruktur von CYP3A4 mit Häm-Gruppe (PDB: 4I3Q, 2013)

Außer Häm b gibt es außerdem noch Häm a und Häm c (und einige weitere). Häm a und Häm c sind beides Teil von Enzymen der Atmungskette, also ebenfalls wichtig für die Energiegewinnung.

fMRI dank Häm

Das Häm-Eisen besitzt außerdem eine chemische Eigenschaft, die uns die effektive Untersuchen von Hirnfunktionen ermöglicht. Um das zu verstehen, müssen wir uns erst die Chemie der Sauerstoffbindung durch Häm etwas genauer anschauen. Wenn ein Sauerstoff-Molekül an das Häm-Eisen im Hämoglobin bindet, ordnen sich die Elektronen im Eisen-Ion neu an, und das Eisen geht aus dem sogenannten high spin Zustand in den low spin Zustand über. Das hat zwei Konsequenzen: einerseits wird das Eisenion kleiner, und andererseits verändern sich seine magnetischen Eigenschaften.

Bei der funktionalen Kernspintomographie (fMRI) – einer Untersuchungsmethode für Vorgänge im Gehirn – macht man sich diese Veränderung der magnetischen Eigenschaften zunutze. Damit lässt sich dann (mithilfe vieler weiterer Zwischenschritte, die ich and dieser Stelle mal weglasse) bildlich darstellen, welche Regionen des Gehirns gerade aktiv sind.

Porphyrien – wenn die Häm-Synthese gestört ist

Da Häm so wichtig ist, verwundert es auch nicht, dass Störungen in der Biosynthese von Häm Krankheiten verursachen. Diese Krankheiten nennt man Porphyrien und werden durch Defekte in den Enzymen verursacht, die Häm aufbauen.

Je nachdem, welches der Enzyme nicht funktioniert reichert sich ein unterschiedliches Zwischenprodukt der Häm-Biosynthese an und es treten unterschiedliche Symptome auf. Oft äußern sich Porphyrien mit sehr starken, plötzlich auftretenden Bauchschmerzen, es können aber auch neurologische Probleme oder Psychosen auftreten. Ein berühmter Fall ist der ehemalige britische König Georg III, der an einer psychischen Erkrankung litt, die vermutlich durch eine akute intermittierende Porphyrie verursacht wurde.

Das war meine Biomolekül des Monats. Falls es euch gefallen hat, dann schaut doch gerne auch in das Biomolekül des letzten Monats rein oder abonniert meinen Email-Newsletter, um keinen neuen Beitrag mehr zu verpassen.

Zelltherapie gegen Krebs: Was CAR-T-Zellen können und was sie nicht können

In den letzten Jahrzehnten hat die Medizin wirklich enorme Fortschritte gemacht, und in kaum einem anderen Bereich ist das so spürbar wie in der Krebstherapie. Tumorerkrankungen, die früher ein quasi sicheres Todesurteil darstellten, haben heute Heilungswahrscheinlichkeiten von 90% oder mehr! Möglich gemacht wurde das von einigen revolutionären Tumortherapien, die unsere Behandlungsmöglichkeiten nach und nach erweiterten. Angefangen hat in den 1940er Jahren alles mit N-Lost als erstes richtiges Zytostatikum. Richtig große Sprünge hat die Tumortherapie aber auch in den letzten Jahrzehnten gemacht, als zum Beispiel die ersten monoklonalen Antikörper aufkamen, oder mit Imatinib als der erste Tyrosinkinase-Inhibitor, der eine ganze Klasse von Wirkstoffen begründet hat. Aber hier soll es um eine der neuesten Revolutionen der Krebstherapie gehen, die CAR-T-Zellen. Und vor allem soll es darum gehen, wie die CAR-T-Zelltherapie in Zukunft noch effektiver und vielseitiger werden könnte.

Zelltherapie mit chimären Rezeptoren

Bei CAR-T-Zellen handelt es sich um den Wirkstoff (ja, auch ganze Zellen können ein Wirkstoff sein!) einer Zelltherapie zur Behandlung verschiedener Krebserkrankungen. Und das Prinzip dahinter ist so simpel wie genial: denn die CAR-T-Zelltherapie ermöglicht es unserem Immunsystem, Tumorzellen zu erkennen und zu töten. Dazu werden Patient:innen eine Art von Immunzellen – die T-Lymphozyten – entnommen, die dann gentechnisch modifiziert werden. Mithilfe eines viralen Vektors wird ein Gen in die Zellen eingeschleust, das für einen chimären Antigenrezeptor codiert (= CAR). Dafür werden z.B. Lentiviren verwendet, die häufig zur Transduktion (= Gentransfer durch Viren) von Säugerzellen eingesetzt werden. Das Gen wird in das Erbmaterial der T-Zellen eingebaut, die den chimären Antigenrezeptor daraufhin stabil exprimieren. Es ist dieser chimäre Rezeptor, der es den CAR-T-Zellen ermöglicht, Tumorzellen zu erkennen. Aber wieso? Wie schafft er es, den Zellen diese Fähigkeit zu verleihen?

Übersicht über den Ablauf der CAR-T-Zelltherapie (Bild: Michels, A. et al. 2020, DOI 10.1007/s00103-020-03222-8, CC BY 4.0)

Zusammengepuzzelte CARs

Manche Krebsarten exprimieren vermehrt bestimmte Antigene. Das bedeutet, dass von einer oder mehreren Arten von Proteinen mehr gebildet wird und diese dann auch auf der Oberfläche der Krebszellen sichtbar sind. CARs werden so entworfen, dass sie genau diese Antigene erkennen können. Häufig ist der Bereich der CARs, der dafür zuständig ist, an der Antigen-bindenden Struktur von Antikörpern orientiert. An dieser Antigen-bindenden Domäne hängt ein Linker, der sie mit einer Transmembrandomäne verbindet. Diese liegt (wie der Name vermuten lässt) innerhalb der Membran der CAR-T-Zellen. Sie leitet das Signal, dass der Rezeptor ein Tumor-Antigen gebunden hat, in das Innere der Zelle weiter. Die Transmembrandomäne stammt normalerweise aus einem von mehreren natürlich vorkommenden Proteinen aus Immunzellen (u.a. CD28 oder CD3).

Modell eines CARs (pink und orange) in der Memran (grau) zusammen mit dem Signalprotein ZAP70 (blau) (Bild: PDB-101, D. Goodsell, http://doi.org/10.2210/rcsb_pdb/mom_2017_10)

Im Inneren der Zelle angekommen folgt dann „nur“ noch die Signaldomäne. Sie ist der am ausführlichsten untersuchte Teil der CARs. Sie besteht ebenfalls aus einem Teil des CD3-Antigens, das aus „normalen“ T-Zellen stammt. Die Aktivierung des CARs führt dazu, dass einige Tyrosin-Aminosäuren der Signaldomäne phosphoryliert, also chemisch mit einer Phosphatgruppe verknüpft werden. Phosphorylierungen fungieren in der Biologie häufig als Signalweiterleitung. So auch hier, denn die Phosphorylierung der Signaldomäne aktiviert die T-Zelle, die daraufhin die von ihr erkannte Tumorzelle abtötet. Das allein reicht aber oft nicht aus. Deshalb wurden in der „zweiten Generation“ von CARs co-stimulierende Domänen hinzugefügt. Diese stammen ebenfalls aus Immunzellen und haben dort im Prinzip die gleiche Aufgabe. Sie verstärken das Signal zur Aktivierung von T-Zellen, aber mit dem kleinen Unterschied, dass in natürlichen T-Zellen der T-Zell-Rezeptor und der Co-Stimulator zwei getrennte Proteine sind.

Antigene erkennen ohne Brimborium

Ein chimärer Antigenrezeptor besteht also aus vielen unterschiedlichen Immunzell-Proteinen, die „einfach“ zu einem Rezeptor kombiniert wurden. Aber wieso das Ganze, wenn auch natürlich vorkommende Immunzellen die einzelnen Proteine besitzen? Um das zu verstehen, müssen wir uns erstmal anschauen, wie T-Zellen normalerweise aktiviert werden:

Zuerst ein kleiner Disclaimer: Es gibt diverse unterschiedliche Arten von T-Zellen, und nur eine davon, die zytotoxischen T-Zellen (die auch so schön poetisch T-Killerzellen genannt werden) tötet wirklich von ihr erkannte infizierte oder maligne Zellen ab. Die anderen sind dafür zuständig, Signalmoleküle auszuschütten, die Immunantwort zu regulieren oder ein immunologisches Gedächtnis zu bilden. Behaltet also einfach im Hinterkopf, dass „Die T-Zelle tötet die erkannte Zelle ab“ eine starke Vereinfachung ist.

Aber wie funktioniert dieses Erkennen und Abtöten jetzt? Zu diesem Zweck haben die T-Zellen den T-Zell-Rezeptor (der – wie das meiste in der Immunologie – ganz schön kompliziert aufgebaut ist). Mit diesem Rezeptor können die T-Zellen Antigene erkennen. In diesem Fall sind das Bestandteile von infizierten oder entarteten Zellen. Der T-Zell-Rezeptor kann diese Antigene aber nicht einfach so erkennen, nein, sie müssen ihm stattdessen von der anderen Zelle präsentiert werden. Dafür gibt es spezielle Proteine, die MHC-I heißen. Mit deren Hilfe präsentieren Zellen Schnipsel von quasi allen Proteinen, die sich in ihrem Inneren befinden. Bindet jetzt der T-Zell-Rezeptor ein Antigen auf einem MHC-I-Komplex, dann kommen die oben schon erwähnten Co-Stimulatoren ins Spiel. Diese müssen auch noch ihre entsprechenden Gegenstücke auf der Antigen-präsentierenden Zelle binden. Und wenn das der Fall ist, dann weiß die T-Zelle, dass es sich bei der Antigen-präsentierenden Zelle z.B. um eine Tumorzelle handelt und tötet sie ab. (Oder entfaltet eine der anderen möglichen Effekte von T-Zellen).

Das Schöne an CAR-T-Zellen ist, dass sie dieses ganze Brimborium mit MHC-I und Co-Stimulatoren nicht brauchen. Sie können Antigene dank der CARs auch einfach so erkennen. Das ist auch gut so, denn manche Krebszellen verzichten einfach darauf, ihre Antigene mit MHC-I zu präsentieren und können deshalb nicht vom Immunsystem erkannt werden (das ganze nennt sich Immunevasion). Die CAR-T-Zellen ermöglichen es dem Immunsystem aber wieder, diese Tumorzellen trotzdem zu erkennen und zu bekämpfen.

Künstlerische Darstellung einer CAR-T-Zelle (blau), die mit ihren CARs (rot) eine Leukämiezelle (grün) erkennt und attackiert (Bild: PDB-101, D. Goodsell, http://doi.org/10.2210/rcsb_pdb/mom_2017_10)

Was CAR-T-Zellen können und was sie nicht können

Aktuell sind sechs CAR-T-Zelltherapien in der EU zugelassen. Sie erkennen eines der beiden Proteine CD19 und BCMA, die in B-Lymphozyten vorkommen. Daher werden diese CAR-T-Zelltherapien auch bei Tumorerkrankungen von B-Lymphozyten wie beispielsweise der akuten lymphatischen Leukämie eingesetzt. Diese Behandlungen sind zwar extrem teuer – mehrere hunderttausend Euro – aber auch oft die letzte Hoffnung für Patient:innen. Und tatsächlich erreichen die CAR-T-Zelltherapien zum Teil sehr beeindruckende Heilungsraten.

Aber wieso werden CAR-T-Zellen dann nicht für viel mehr Arten von Krebserkrankungen verwendet? Die CAR-T-Zelltherapie bringt auch einige Schwierigkeiten mit sich. Einerseits können die CAR-T-Zellen sehr drastische Nebenwirkungen und toxische Effekte haben. Eine der Nebenwirkungen, das manchmal sogar lebensbedrohliche Zytokin-Freisetzungssyndrom, entsteht vermutlich, weil die CAR-T-Zellen “zu gut” sind. Denn weil auf einmal massenhaft Tumorzellen absterben, werden sehr viele Botenstoffe freigesetzt, die beispielsweise Fieber und Atembeschwerden auslösen können.

Außerdem ist die Verwendung von CAR-T-Zellen bei soliden Tumoren eine besondere Herausforderung. Denn einerseits müssen die CAR-T-Zellen erstmal einen Weg finden, in diese Tumore eindringen zu können. Andererseits schaffen Tumore sich oft eine Umgebung, in der Immunreaktionen unterdrückt werden. Zudem sind die Antigene aus soliden Tumoren viel häufiger auch in gesunden Zellen vorhanden, so dass es zu on-target off-tumor Effekten kommen kann, bei denen die CAR-T-Zellen gesundes Gewebe angreifen.

Allogene und ausschaltbare CAR-T-Zellen

Welche Möglichkeiten gibt es, diese Probleme zu lösen? Eine mögliche Lösung für die hohen Kosten könnten sogenannte allogene CAR-T-Zellen sein. Denn bisherige CAR-T-Zelltherapeutika werden aus den eigenen Zellen von Patient:innen hergestellt. Daher ist das jedes Mal ein individueller Prozess. Die Zellen von externen Spender:innen zu verwendet würde es ermöglichen, CAR-T-Zellen schon im Voraus in größeren Mengen herzustellen. Außerdem wären sie dadurch sofort einsatzbereit, anstatt erst nach der individuellen Herstellung, während der die Erkrankung weiter fortschreiten kann. Allerdings müssen dafür neue Probleme gelöst werden. Denn die fremden T-Zellen könnten zu einer Graft-versus-Host-Reaktion führen, also einer zytotoxischen Reaktion auf die allogenen Zellen. Außerdem werden die allogenen CAR-T-Zellen schneller durch das Immunsystem von Patient:innen beseitigt.

Um das Problem der Toxizität zu lösen, können Veränderungen am CAR selbst vorgenommen werden. Die co-stimulierende Domäne hat zum Beispiel einen großen Einfluss auf die Entstehung des Zytokin-Freisetzungssyndrom. Und tatsächlich könnte es auch helfen, die Affinität des Rezeptors für das Antigen zu verringern. Das vermindert zwar etwas die Wirksamkeit, aber vor allem attackieren die CAR-T-Zellen dadurch kaum noch gesundes Gewebe, sondern nur noch Tumorzellen.

Eine sehr spannende Möglichkeit sind ausschaltbare CAR-T-Zellen. Sie können durch die Gabe eines anderen Stoffs ausgeschaltet werden, sobald zu starke Nebenwirkungen auftreten. Das hat allerdings den Nachteil, dass dann keine CAR-T-Zellen mehr vorhanden sind, um die ursprüngliche Erkrankung zu bekämpfen. Daher wären CAR-T-Zellen am besten, die reversibel ausgeschaltet werden können. Eine Möglichkeit dafür, die schon untersucht wurde, ist der Tyrosinkinasehemmer Dasatinib. Es verhindert, dass die CAR-T-Zellen aktiviert werden können. Sobald es allerdings nicht mehr gegeben wird, sind die Zellen wieder aktivierbar und einsatzbereit.

Fazit

Das war jetzt ein ziemlich langer Text, aber über CAR-T-Zelltherapie gibt es auch einfach viel zu sagen. Das Konzept ist super spannend, und die Möglichkeit, Immunzellen so zu verändern, dass sie gegen Tumorzellen vorgehen, ist ein enormer Erfolg in der Krebstherapie.

Trotzdem müssen wir Wege finden, um das Konzept breiter anwenden zu können, gerade für solide Tumore. Auch dafür existieren tatsächlich schon Ideen (z.B. probiotic-guided CAR-T-Zellen), wie auch für viele andere Möglichkeiten, die Hürden zu einer breiteren Anwendung zu überwinden. Die Forschung an CAR-T-Zellen geht auf jeden Fall weiter, und wir werden abwarten müssen, ob und welche weiteren CAR-T-Zelltherapeutika ihren Weg in die Klinik finden.

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Wirkstoffe mit neuem Wirkprinzip: PROTACs

Viele Arzneistoffe funktionieren nach dem gleichen Prinzip. Der Wirkstoff bindet an ein Enzym und hemmt es. Zum Beispiel Ibuprofen, das an das Enzym COX bindet und seine Funktion hemmt. Denn COX produziert normalerweise entzündungsfördernde Stoffe, was durch Ibuprofen dann verhindert wird. Das ist ein lang erprobtes und sehr erfolgreiches Prinzip. Aber es hat auch Schwächen und Limitation, und um die zu überwinden, braucht es Arzneistoffe, die nach einem neuen Prinzip funktionieren. 2001 wurde eine solche Gruppe von Arzneistoffen entdeckt, die seither in der Arzneistoffentwicklung immer beliebter wird: die PROTACs.

In diesem Text geht es um diese neue Gruppe von Arzneistoffen. Darum, was PROTACs so anders macht, was sie besser können als andere Stoffe, und welche Probleme vielleicht noch überwunden werden müssen.

Was sind PROTACs?

PROTAC steht für PROteolysis Targeting Chimera, und in diesem Namen steckt schon sehr viel von dem was PROTACs tun: Proteolyse bezeichnet den Abbau von Proteinen. Es gibt viele unterschiedliche Gründe, weshalb Proteine in einer Zelle abgebaut werden sollten. Daher ist es auch nicht überraschend, dass es dafür eine eigene Maschinerie in der Zelle gibt, das Proteasom. Aber woher weiß das Proteasom, welche Proteine nicht mehr gebraucht werden? Die Proteine, die im Proteasom abgebaut werden sollen, sind dafür mit Ubiquitin markiert, dem Signal zum Abbau.

Struktur des menschlichen 20S Proteasoms (Toste Rego et.al., Mol Cell, 2019)

Durch die Ubiquitinierung (die Verknüpfung eines Protein mit Ubiquitin) weiß das Proteasom also, dass eben dieses ubiquitinierte Protein abgebaut werden soll. Aber wie kommt das Ubiquitin an dieses Protein? Das geschieht nicht einfach so, sondern durch Enzyme: E1, E2 und E3 (und ja, wie die meisten Enzyme haben die eigentlich längere und kompliziertere Namen, aber das soll uns jetzt egal sein).

Genau an dieser Stelle setzen die PROTACs an: Denn sie sorgen dafür, dass ein bestimmtes Protein durch diese Enzyme ubiquitiniert und damit für den Abbau markiert wird. Wenn wir das mit „normalen“ Arzneistoffen vergleichen, wird der unterschied sehr deutlich: Ein „normaler“ Arzneistoff hemmt ein Enzym oder einen Rezeptor, das oder der dann nicht mehr richtig arbeiten kann. Ein PROTAC sorgt nicht dafür, dass sein Zielprotein (sein Target) nicht mehr richtig funktioniert, sondern stattdessen direkt komplett abgebaut wird und deshalb seine Funktion nicht mehr erfüllen kann.

Bevor wir uns anschauen, was das für Vorteile hat und wieso PROTACs gerade so beliebt sind, müssen wir aber erst einmal verstehen, wie sie funktionieren. Und dafür müssen wir uns genauer mit ihrer Chemie beschäftigen.

Die Chemie der PROTACs

PROTACs bestehen aus drei Teilen: Einem Teil, der an das Zielprotein bindet, einem Teil, der an das E3-Enzym bindet, und einem Linker, der die beiden anderen Teile miteinander verbindet. Sie sind also bifunktional, weil sie an zwei Proteine gleichzeitig binden können.

Für die Interaktion mit E3 gibt es natürlich verschiedene Möglichkeiten. Zum Beispiel kann der E3 Ligand entweder ein Peptid sein (also aus Aminosäuren aufgebaut) oder auch ein small molecule. Und auch die Wahl des richtigen Linkers ist nicht so einfach. Wie lang muss der Linker sein? Wie flexibel muss er sein? Wo muss er an den anderen Teilen befestigt sein? Und wie stört er die Bindung an das Target und an E3 nicht? Letztendlich gilt es dann noch, den richtigen Liganden für das Zielprotein auszuwählen. Wir schauen uns das mal am Beispiel des Stoffes SK-575 an:

SK-575 sorgt für den Abbau des Enzyms PARP1, das DNA-Brüche repariert und dessen Hemmung in der Krebstherapie ausgenutzt wird. Der PARP1-bindende Teil ist Olaparib, ein Stoff, der auch allein PARP1 hemmen kann und deshalb vorher schon als Arzneistoff verwendet wurde. Der Linker ist dann eine ziemliche unpolare Alkylkette (fast nur Kohlenstoff und Wasserstoff), an dem die beiden anderen Teile über zwei Amide befestigt sind. Der E3-bindende Teil von SK-575 ist Thalidomid, das bereits als Wirkstoff z.B. bei Lepra verwendet wird. Aber der eine oder die andere wird jetzt wohl aufhorchen. Denn Thalidomid ist der Wirkstoff in Contergan, das in den 50er und 60er Jahren den Contergan-Skandal ausgelöst hat.

Struktur von SK-575 (Cao et al., Chem. Soc. Rev. 2022)

Thalidomid wurde bis in die 60er Jahre in dem Schlafmittel Contergan verwendet, das hauptsächlich an Schwangere vermarktet wurde. Leider löste es bei den ungeborenen Kinder schwere Fehlbildungen aus. Es bindet nämlich an eine Untereinheit von E3, wodurch der Abbau von bestimmten Proteinen verhindert und die Entwicklung der Gliedmaßen gestört wird.

Aber eben genau diese Eigenschaft, an E3 binden zu können, macht Thalidomid für die PROTACs so interessant. Es macht es möglich, PROTACs herzustellen, die sehr effizient an E3 binden und gleichzeitig viele andere Eigenschaften aufweisen, die ein Arzneistoff haben muss (z.B. dass die PROTACs überhaupt in die Zellen gelangen können). Selbstverständlich erfolgt der arzneiliche Einsatz von Thalidomid (und der anderen IMiDs Lenalidomid und Pomalidomid) heutzutage unter strenger ärztlicher Überwachung und niemals bei Schwangeren.

Die Wirkungsweise der PROTACs

Wir wissen jetzt, dass PROTACs bifunktional sind und gleichzeitig das Zielprotein und E3 binden können. Das Gebilde aus Target, E3 und PROTAC wird als ternärer Komplex bezeichnet. In dem ternären Komplex sind sich das E3-Enzym und das Target nahe genug, damit E3 (zusammen mit E2) seine Arbeit machen kann: es ubiquitiniert das Zielprotein und markiert es dadurch für den Abbau durch das Proteasom.

Das Schicksal des Zielproteins ist also besiegelt. Die Peptidbindungen zwischen seinen Aminosäuren werden gespalten und das Protein wird zerstört. Die dabei freiwerdenden Aminosäuren und Peptidfragmente können dann zum Beispiel verwendet werden, um neue Proteine aufzubauen.

Der PROTAC und E3 werden allerdings nicht mit abgebaut. Sie dissoziieren wieder ab, werden also freigesetzt, und können sich dem nächsten Zielprotein widmen. Dort kann der PROTAC wieder binden, E3 rekrutieren und der ganze Prozess geht wieder von vorne los.

Mit der Zeit wird dadurch ein ziemlich großer Teil aller Zielproteine in der Zelle abgebaut. Das hat auf den ersten Blick betrachtet den gleichen Effekt wie ein klassischer Hemmstoff: Das Zielprotein kann sine Arbeit nicht mehr machen. Wenn wir beim Beispiel SK-575 und Olaparib bleiben, dann kann das Target PARP1 keine DNA-Brüche mehr reparieren, und die Krebszelle stirbt.

Aber auf den zweiten Blick gibt es einige wichtige Unterschiede zwischen den PROTACs und klassischen Hemmstoffen, die wir uns jetzt anschauen.

Was haben PROTACs, was die anderen nicht haben?

Einen entscheidenden Vorteil habe ich zumindest schon angerissen. Denn da PROTACs nach dem Abbau des Targets wieder freigesetzt werden, ist ihr Wirkmechanismus katalytisch. Das bedeutet, dass nicht ein Molekül Arzneistoff für jedes einzelne Zielprotein gebraucht wird, sondern dass ein PROTAC-Molekül potentiell unendlich (potentiell heißt hier, in der Realität natürlich nicht unendlich, aber zumindest viele) Zielproteine in den Abbau führen kann. Dadurch braucht man eine sehr geringe Konzentration an Arzneistoff, um einen Effekt zu erzielen. Das ist besonders praktisch, wenn dadurch die Dosis eines Arzneistoffs mit starken Nebenwirkungen verringert werden kann, oder bei Stoffen, die ansonsten zu giftig wären, um sie einsetzen zu können.

Ein weiterer, sehr großer Vorteil ist, dass es bei PROTACs egal ist, wo sie an ihr Target binden. Denn klassische Hemmstoffe haben da keine Wahl, es gibt an ihren Zielproteinen nur eine oder wenige Stellen, die sie binden können, um die Aktivität des Zielproteins zu verändern – entweder das aktive Zentrum oder eine allosterische Bindestelle. Weil PROTACs die Funktion ihres Zielproteins nicht direkt beeinflussen müssen, können sie auch buchstäblich überall daran binden. Das führt auch dazu, dass sogenannte undruggable targets adressiert werden können, die zum Beispiel gar kein aktives Zentrum haben.

Und dann gibt es noch ein paar weitere Beispiele. So können klassische Hemmstoffe auch oft wieder aus der Bindung mit dem Zielprotein verdrängt werden, wenn der endogene Ligand bindet (Stichwort kompetitive Hemmung). Bei PROTACs kann das natürlich nicht passieren, denn wenn das das Zielprotein einmal abgebaut ist, ist es halt weg. Und auch die Entwicklung von Resistenzen gegen einen Arzneistoff könnte bei PROTACs unter Umständen langsamer ablaufen.

Und wo ist der Haken?

Ich muss zugeben, dass „wo ist der Haken?“ eine ziemlich provokante Frage ist. Denn PROTACs sind ein sehr vielversprechender Ansatz in der Arzneistoffentwicklung, und es gibt (noch, zumindest) keinen wirklichen Haken dabei. Aber es gibt eben auch einige Nachteile und offene Fragen, die ich euch nicht verschweigen möchte.

Ein Problem könnte sein, dass das Zielprotein zwar abgebaut wird, sich der gewünschte Effekt aber trotzdem nicht einstellt. Es kommt nämlich vor, dass die Funktion des Zielproteins dann einfach von einem anderen Protein übernommen wird, und der PROTAC damit praktisch unwirksam wird (zumindest teilweise). Dazu kommt noch, dass extrem viele verschiedene Formen des E3-Enzyms existieren, aber die meisten PROTACs nur auf ein paar wenige beschränkt sind. Eine Herausforderung für die Entwicklung neuer Stoffe ist also, auch diese E3-Formen als Ansatzpunkt für PROTACs zu gewinnen. Außerdem sind PROTACs oft sehr groß (also in molekularem Maßstab) und häufig relativ instabil oder reaktiv. Das macht es zu einer Herausforderung, dass sie nach peroraler Einnahme auch im Blutkreislauf und dann am Wirkort ankommen.

Oder, wie dieser Preprint zeigt, kann der Abbau bestimmter Proteine auch unerwartete Effekte haben (Derek Lowe hat auch einen sehr guten Text darüber geschrieben). Denn beim Abbau entstehen Peptide, die wiederum die Apoptose, also den programmierten Zelltod, auslösen. Das kann von Vorteil sein, z.B. bei der Krebsbehandlung, wenn sowieso das Ziel ist, dass Tumorzellen absterben. Wenn die Zellen aber nicht sterben sollen, kann das ein ziemliches Problem darstellen.

Die Zukunft von PROTACs in der Arzneistoffentwicklung

So, wir haben jetzt eine ganze Menge über PROTACs gelernt. Da stellt sich die Frage, wie relevant sie weiterhin in der Arzneistoffentwicklung, und letztendlich auch im klinischen Alltag sein werden.

Ich bin nicht in der Arzneistoffentwicklung tätig und habe daher auch eher einen beschränkten Überblick über das Feld. Aber in den letzten Jahren ist die Zahl der Veröffentlichungen über PROTACs deutlich angestiegen, und ich denke, dass sich das Interesse an ihnen auch noch lange anhalten wird.

Natürlich werden auch die traditionellen Hemmstoffe weiter ihren Platz in der Arzneistoff-Landschaft haben, aber das PROTAC-Prinzip scheint gut geeignet, um einige ihrer Limitationen zu überwinden. Ich denke daher, dass wir bald schon PROTACs auch in der klinischen Anwendung sehen werden.

Wenn ihr euch mehr einlesen wollt, kann ich dieses Review von 2022 empfehlen, und außerdem dieses wirklich sehr ausführliche Review, auf die ich auch diesen Text hauptsächlich gestützt habe.

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Biomolekül des Monats: Das Ribosom

Ich denke, es ist schon in mehreren meiner Texte deutlich geworden, dass Proteine extrem wichtig, facettenreich und spannend sind. Laut der Deutschen Gesellschaft für Ernährung besteht jede:r von uns aus etwa 7 bis 13 kg davon. Und diese Menge an Proteinen muss erst einmal hergestellt werden. Deshalb besitzt jeder Mensch in etwa 100 Trillionen (also 100.000.000.000.000.000.000) Stück des Organells, das für die Biosynthese von Proteinen zuständig ist: Das Ribosom. In diesem Text möchte ich euch zeigen, wie Ribosomen funktionieren und kann euch hoffentlich einen Eindruck davon vermitteln, wieso ich sie so faszinierend finde.

Was sind Ribosomen, und wie funktionieren sie?

Obwohl das Ribosom bisher das bisher größte Biomolekül des Monats ist und wohl auch für einige Zeit bleiben wird, ist es für ein Organell ziemlich klein. Ribosomen haben gerade einmal einen Durchmesser von ca. 20 nm und ein Gewicht von 4,2 MDa (= Megadalton). Da steht für Dalton und ist eine Einheit, die oft für (Bio-)Moleküle verwendet wird. Ein Dalton entspricht ungefähr dem Gewicht eines Protons oder Neutrons. Ein Ribosom wiegt damit in etwa ein trillionstel Gramm.

Ribosomen stellen zwar Proteine her, bestehen aber zum Teil auch selbst aus Proteinen. Außerdem bestehen sie aus RNA, die deshalb rRNA (ribosomale RNA) genannt wird. Aufgebaut sind Ribosomen aus zwei Untereinheiten, einer großen und einer kleinen.

Cryo-EM Struktur eines menschlichen Ribosoms (Khatter et al. 2015, https://doi.org/10.1038/nature14427 )

Zwischen diesen Untereinheit können Ribosomen einen mRNA-Strang binden (wie bei einem Burger: die Untereinheiten sind die Brötchenhälften und die mRNA ist der Belag). Die mRNA transportiert die Information, die auf DNA gespeichert ist, aus dem Zellkern zu den Ribosomen in das Cytosol. Ribosomen können dann die Protein-Baupläne, die auf der mRNA als Basenabfolge codiert sind, in eine Aminosäuresequenz übersetzen – und das Protein dann auch gleichzeitig herstellen.

Dazu benutzten Ribosomen nochmal eine andere Art von RNA: die tRNA. Wenn das Ribosom der Übersetzer zwischen mRNA und Protein ist, dann ist die tRNA das Wörterbuch. Sie kann – innerhalb des Ribosoms – an die mRNA binden. Jeweils drei Basen in der mRNA codieren für eine Aminosäure in einem Protein. Diese drei Basen (das Codon) erkennt die tRNA, und an ihrem anderen Ende trägt sie die passende Aminosäure. Wenn die tRNA an die mRNA bindet, wird diese Aminosäure dann zu der wachsenden Kette aus Aminosäure hinzugefügt. Für eine ausführlichere Erklärung dieses Prozesses (der Translation) schaut doch gerne hier.

Animation der Funktionsweise eines Ribosoms: Die große UE ist grün, die kleine UE ist gelb. Die blauen tRNA-Moleküle binden an den mRNA-Strang und die Aminosäurekette wächst. (Quelle: Bensaccount at en.wikipedia, CC BY 3.0)

Ich möchte jetzt nämlich noch eines der (für mich) faszinierendsten Dinge in der Biologie ansprechen: Den Fakt, dass es nur 20 verschiedene Aminosäuren gibt, aus denen Proteine bestehen können. (Der eine oder die andere wird jetzt Fragen: was ist mit Pyrrolysin und Selenocystein, sollten es dann nicht 22 Aminosäuren sein? Und ja, das stimmt, aber die beiden sind Spezialfälle und wir ignorieren sie jetzt einfach.) Obwohl es nur diese 20 verschiedenen Aminosäuren gibt, besitzen allein Menschen um die 100.000 verschiedene Proteine. Die haben außerdem extrem unterschiedliche Aufgaben, z.B. als Enzyme, als Transporter, als Antikörper oder als Strukturproteine wie Keratin, aus dem Haare bestehen. Und trotzdem, obwohl es eine solche unglaubliche strukturelle und funktionelle Vielfalt gibt, bestehen diese 100.000 unterschiedlichen Proteine nur aus 20 verschiedenen Aminosäuren.

Ribosomen und Antibiotika

Weil das hier ein Blog über die Wissenschaft hinter Arzneimitteln ist, gibt es noch eine Sache, die ich unbedingt ansprechen muss: Das sind die Antibiotika, die an der Proteinbiosynthese angreifen. Davon gibt es tatsächlich auch eine ganze Menge, zum Beispiel Erythromycin, Tetracyclin oder Gentamicin.

Das ist möglich, weil sich die Ribosomen von Eukaryoten (Lebewesen, die Zellkerne besitzen) wie Menschen relativ stark von den Ribosomen von Bakterien unterscheiden. Die eukaryotischen Ribosomen werden als 80S Ribosomen bezeichnet. S steht für Svedberg und ist eine etwas umständliche Einheit, die (in diesem Fall) vor allem die Größe der Ribosomen beschreibt. (Genau genommen ist es die Einheit für den Sedimentationskoeffizienten. Der hängt neben der Masse eines Teilchen von dessen Form und den Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel ab. Da Form und Wechselwirkungen bei Ribosomen aber ähnlich sind, beschreibt es hier v.a. den Massenunterschied.)

Die eukaryotischen 80S Ribosomen bestehen aus einer 60S Untereinheit und einer 40S Untereinheit. Die bakteriellen Ribosomen dagegen sind kleiner, es sind 70S Ribosomen mit einer 50S und einer 30S Untereinheit. Dieser Unterschied im Aufbau der Ribosomen ermöglicht es, dass Antibiotika selektiv nur an bakteriellen Ribosomen wirken können. Dadurch wird die Proteinbiosynthese der Bakterien gestört und sie sterben ab, während menschliche Zellen unbeschadet bleiben.

Natürlich gäbe es zu Ribosomen noch sehr viel mehr zu sagen. Trotzdem soll es das mit diesem Biomolekül des Monats jetzt gewesen sein. Wenn es euch gefallen hat, dann lest gerne auch den Beitrag von letztem Monat oder abonniert meinen Newsletter, um nichts mehr zu verpassen (am Desktop auf der rechten Seite oder am Handy ganz unten)!

Ein biophysikalischer Hype: Die EPR-Spektroskopie

Es gibt sehr viele unterschiedliche Methoden, um Proteine zu untersuchen. Viele davon sind biophysikalische Methoden: Dabei werden physikalische Eigenschaften ausgenutzt, um biologische Fragestellungen zu beantworten. Eine dieser biophysikalischen Techniken, die derzeit ganz schön im Trend liegt (falls man das so sagen kann) ist die EPR-Spektroskopie.

Ich musste mich für die Arbeit ein bisschen mit EPR-Spektroskopie beschäftigen, und als Nicht-Physiker bin ich gegenüber Dingen, für deren Erklärung man mehr als drei Gleichungen braucht, etwas skeptisch eingestellt. Deshalb halte ich mich an den alten Grundsatz „Du hast etwas erst dann richtig verstanden, wenn du es anderen erklären kannst“ und schreibe einen kurzen Blogbeitrag darüber. Aber keine Sorge, ich werde nicht mit Gleichungen um mich werfen (Nicht-Physiker, ihr erinnert euch), sondern wir werden uns auf einer eher konzeptuellen Ebene anschauen, was die EPR-Spektroskopie ist, was sie kann und wieso sie gerade so „gehyped“ ist.

Electron Paramagnetic Resonance

Fangen wir mit dem Offensichtlichen an: Wofür steht EPR? Es ist die Abkürzung für electron paramgnetic resonance, was auf Deutsch üblicherweise als Elektronenspinresonanz (ESR) übersetzt wird. Wir werden uns nachher noch genauer mit den physikalischen Grundlagen beschäftigen, daher erstmal nur so viel: Ein Protein wird in ein starkes Magnetfeld gebracht und mit Mikrowellen beschossen. Die Art und Weise, wie das Protein mit den beiden interagiert liefert dann zum Beispiel wichtige Hinweise über die Struktur des Proteins.

Aber wieso diesen ganzen Aufwand treiben, nur für „wichtige Hinweise“ über die Struktur eines Proteins? Was ist an dieser Struktur so besonders? Und außerdem gibt es doch, wie ich in der Einleitung selbst erwähnt habe, noch andere Methoden, um die Struktur von Proteinen zu untersuchen. Da wäre zum Beispiel die Röntgenkristallographie, mit der sogar Auflösungen von unter einem Angström (0,1 nm) erreicht werden können. Wieso nicht einfach diese etablierten Verfahren verwenden?

Struktur und Dynamik von Proteinen

Erst einmal so viel: die Struktur eines Proteins ist oft das, was auch seine Funktion ausmacht. Immerhin bestehen Proteine nur aus 20 verschiedenen Aminosäuren, die zu langen Ketten aneinander gereiht werden. Aber diese Ketten formen dann komplexe dreidimensionale Strukturen (auch Konformation genannt). Sie bringen die richtigen Aminosäuren an die richtige Stelle und können dadurch katalytisch aktive Zentren von Enzymen bilden, oder Gerüste, an die andere Proteine binden können, oder Carrier, die Stoffe durch Zellmembranen transportieren, oder…

Man könnte lange so weitermachen, denn die Struktur ist eben eine sehr entscheidende Eigenschaft von Proteinen. Aber Proteine sind nicht starr. Sie können sich bewegen, zwischen verschiedenen Konformationen hin und her wechseln. Zum Beispiel zwischen einer aktiven und einer inaktiven Konformation (schaut mal in meinem Text zu biased ligands, da habe ich auch ein bisschen darüber geschrieben). Und diese Bewegung ist die Dynamik von Proteinen, die für ihre Funktion genauso wichtig ist.

Die Funktion des Enzyms ATP-Synthase wird durch Konformationsänderungen ermöglicht. (Bild: PDB-101)

Viele klassische Methoden können diese Dynamik nicht abbilden. Sie zeigen starre, unbewegliche Strukturen. Die EPR-Spektroskopie ist hingegen eine Technik, mit der man diese Dynamik untersuchen kann. Und dabei spielt es dann keine Rolle, ob diese Bewegung winzig klein oder (zumindest im Proteinmaßstab) sehr groß ist.

Was gehört da dazu? Zum Beispiel geht es darum, wie Transporter funktionieren, die Kupfer-Ionen über die Zellmembran transportieren, wie dieses Review hier zeigt. Oder darum, wie Rezeptoren aktiviert werden und die entsprechenden Signalkaskaden in der Zelle auslösen. Das wiederum kann wertvoll für die Entwicklung von Arzneistoffen sein, die an diesen Rezeptoren angreifen.

Ein bisschen Physik

Die EPR-Spektroskopie kann uns also zeigen, wie Proteine funktionieren, indem sie Aufschluss über die Struktur von Proteinen und die Dynamik dieser Struktur liefert. Jetzt bleibt nur noch zu fragen: wie macht sie das?

Dafür müssen wir uns jetzt doch ein bisschen mit der Physik dahinter beschäftigen. Die Grundlage ist das Verhalten von ungepaarten Elektronen in einem Magnetfeld. In diesem Magnetfeld können die Elektronen zwei verschiedene Energiezustände einnehmen. Je stärker das Magnetfeld ist, desto größer ist auch der Unterschied zwischen den beiden Zuständen.

Das Energieniveau der beiden Zustände, die ein ungepaartes Elektron einnehmen kann. Ohne äußeres Magnetfeld sind beide Zustände energetisch gleich. Je stärker das äußere Magnetfeld ist, desto größer ist der Energieunterschied zwischen den Zuständen. (Bild: Krishnavedala, Public Domain)

Da die Natur immer den Zustand mit der niedrigsten Energie bevorzugt, werden sich die meisten der ungepaarten Elektronen in dem Zustand mit niedrigerer Energie befinden (siehe Boltzmann-Verteilung). Wenn die Elektronen jetzt mit Mikrowellen beschossen werden (elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen zwischen 1 mm und 30 cm, keine Küchengeräte), deren Energie genau der Energiedifferenz zwischen den beiden Zuständen entspricht, dann können die Elektronen in den höheren Energiezustand wechseln, und dabei die Mikrowellenstrahlung absorbieren.

Genau diese Absorption kann man messen. Und jetzt kommt der Clou: Sie ist abhängig von der Umgebung der ungepaarten Elektronen. Deshalb kann man daraus Rückschlüsse auf diese Umgebung und auf Veränderungen der Umgebung ziehen. Zum Beispiel eben andere Teile des Proteins, die ein ungepaartes Elektron umgeben, oder Teile eines anderen Proteins, oder auch die Zellmembran. Daraus können dann eben solche Dinge wie Konformationsänderungen von Proteinen abgeleitet werden.

(Wenn ihr die vorherigen Abschnitte schon verwirrend fandet, dann überspringt diesen hier am besten. Ich möchte hier nämlich einige Dinge präzisieren, die ich oben nur angeschnitten habe:

1.) Der Unterschied in der Besetzung der Energieniveaus ist ein statistischer Effekt. Es befinden sich mehr Elektronen im energetisch günstigeren Zustand. Es können aber Elektronen durch Abgabe von Photonen genauso nach „oben“ wechseln wie durch Absorption nach „unten“. Da sich „unten“ aber von Anfang an mehr Elektronen befinden, ergibt sich ein Nettoübergang in den höheren Energiezustand und eine Absorption der Mikrowellen.

2.) Es gibt natürlich mehr als nur einen Anwendungsmodus der EPR-Spektroskopie mit verschiedenen Möglichkeiten. Zum Beispiel gepulste EPR-Techniken, bei denen nur kurze Mikrowellenpulse benutzt werden. Damit können dann unter anderem Abstände zwischen zwei ungepaarten Elektronen gemessen werden.)

Spin-Label mit stabilen Radikalen

Mit einem allerletzten Problem müssen wir uns noch beschäftigen, bevor wir uns zurücklehnen und die EPR-Wissenschaftler:innen einfach machen lassen können. Denn wir brauchen für die EPR-Spektroskopie ja ungepaarte Elektronen. Die haben aber die blöde Eigenschaft, dass sie sehr reaktiv sind und deshalb nicht in Proteinen vorkommen.

Deshalb müssen ungepaarte Elektronen künstlich in die Proteine eingeführt werden – außer z.B. bei manchen Metalloproteinen. Wie schon gesagt, sind die meisten Radikale (so nennt man ungepaarte Elektronen auch) ziemlich reaktiv und bleiben deshalb nicht lange erhalten. Es gibt aber ein paar, die stabil genug sind, damit sie sich als sogenannte Spin-Label eignen.

Das sind meistens Nitroxide, bei denen ein Sauerstoffatom das ungepaarte Elektron trägt und an ein Stickstoffatom gebunden ist. Die Spin-Label können an spezifischen Positionen in die Proteine eingefügt werden. Das hat zusätzlich den Vorteil, dass die Lage des Spin-Labels innerhalb der Proteinstruktur frei gewählt werden kann.

Zwei Beispiele für Spin-Label: MTSL und MA-PX

Eine Möglichkeit, die Spin-Label an ein Protein zu binden ist, ist die Aminosäure Cystein. Die gewünschte Position des Proteins kann relativ einfach zu einem Cystein mutiert werden. Das Cystein (genauer das Thiol des Cysteins) kann dann mit dem Spin-Label (z.B. über eine Disulfidbrücke oder Addition an Maleimid) reagieren und dauerhaft verbunden werden.

Mit den Spin-Labeln haben wir jetzt aber alles, was wir brauchen, damit wir die Eigenschaften von Proteinen beobachten können. Die EPR-Spektroskopie nutzt das Verhalten von ungepaarten Elektronen in einem Magnetfeld. Dafür werden Spin-Label spezifisch in ein Protein eingebracht. Deren unmittelbare Umgebung beeinflusst die Ergebnisse, was wertvolle Einblicke in die Struktur und Dynamik liefert, zum Beispiel wenn ein Arzneistoff gebunden wird.

Das ist die Stärke der EPR-Spektroskopie. Sie lässt uns einen Blick auf die Struktur der Proteine werfen, während sie sich bewegen und ihrer Aufgabe nachgehen. Statt eines starren Bildes einer möglichen Konformation lassen sich die Änderungen der Konformation nachvollziehen. Dabei können sehr kleine Bewegungen gemessen werden. Außerdem lassen sich die Proteine einerseits (und typischerweise) in Lösung beobachten, aber auch in ihrer nativen Umgebung, dem Inneren einer Zelle.

Und das er dann auch schon, mein kleiner Ausflug in die Welt dieser gerade etwas gehypten biophysikalischen Methode. Wenn euch dieser Text gefallen hat, dann abonniert doch gerne meine Newsletter (am Desktop in der Seitenleiste rechts, oder mobil ganz unten).

Biomolekül des Monats: Der Tumorsuppressor p53

Ob lange Stränge aus DNA, riesige Proteine aus hunderten Aminosäuren oder kleine Moleküle aus wenigen Atomen: Biomoleküle haben unendlich viele faszinierende Aufgaben, um unsere Körper am Laufen zu halten. Daher stelle ich hier jeden Monat eines davon und seine Besonderheiten vor.

Krebserkrankungen sind meistens sehr komplex, jedoch haben sie alle eine gemeinsame Ursache: Veränderungen im Erbgut einer Zelle, der DNA. Solche Mutationen sind tatsächlich sehr häufig und können durch viele Faktoren ausgelöst werden. Aber glücklicherweise führen nicht alle Mutationen auch zur Entstehung von Tumoren. Denn unsere Zellen besitzen Schutzmechanismen, um genau das zu verhindern. Einer der wichtigsten ist ein Protein mit dem unscheinbaren Namen p53, das ich euch hier vorstellen möchte.

p53-Tetramer gebunden an DNA (Richard Wheeler (Zephyris) CC BY-SA 3.0)

p53 ist ein sogenannter Transkriptionsfaktor. Das sind Proteine, die die Übersetzung von DNA in mRNA regulieren. Letztendlich verhindern oder verstärken sie damit die Expression von bestimmten Proteinen.

Wenn die DNA beschädigt wird führt das dazu, dass sich p53 in der Zelle anreichert. Dadurch kann es dann seine Wirkung als Transkriptionsfaktor entfalten. Dazu gehört, dass p53 den Zellzyklus stoppt. Diesen Zyklus durchlaufen Zellen, bevor sie sich teilen können. Mit dem Stopp verhindert p53 also eine Vermehrung von Zellen mit kaputter DNA.

Das war aber noch nicht alles. Denn wenn sich sehr viel p53 angereichert hat, aktiviert es außerdem Proteine namens Bax. Bax leitet dann die Apoptose ein (bzw. verhindert Bax die Hemmung der Apoptose). Als Apoptose bezeichnet man den programmierten Zelltod, und damit wird letztendlich verhindert, dass sich aus einer Zelle mit irreparablen DNA-Schäden ein Tumor entwickelt.

Wie viele andere Prozesse in der Biologie auch ist die Einleitung der Apoptose ein ziemlich komplexer Signalweg, mit einer Reihe von Proteinen, die einander aktivieren (In kurz: p53 aktiviert Bax, dadurch wird Cytochrom c aus Mitochondrien freigesetzt, das zusammen mit APAF-1 die Caspase-9 aktiviert, die wiederum andere Caspasen aktiviert, die die Apoptose auslösen). Einerseits ist das natürlich gut, damit eine Zelle nicht einfach „ausversehen“ in den programmierten Zelltod geht. Andererseits erfüllen solche Signalkaskaden aber auch die wichtige Aufgabe, das Signal zu verstärken. Denn selbst wenn anfänglich nur wenig Bax aktiviert wird, aktiviert jeder Zwischenschritt dieser Reihe mehrere Proteine des nächsten Schritts, wodurch am Ende der Kaskade deutlich mehr aktivierte Proteine stehen.

Diese beiden Funktionen von p53, Zellzyklus-Arrest und Apoptose, spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Verhinderung von Krebserkrankungen. Deshalb wird p53 auch als Tumorsuppressor bezeichnet, also als ein Tumor-unterdrückendes Protein. Im Gegenzug führt eine Mutation in dem Gen, in dem der Bauplan für p53 codiert ist (das TP53-Gen) aber auch dazu, dass die Entwicklung von Tumoren deutlich wahrscheinlicher wird, weil diese Schutzfunktion fehlt. Tatsächlich ist das oft eine Mit-Ursache für Krebs, und in etwa der Hälfte der Tumore ist das TP53-Gen mutiert.

Und einen kleinen Abstecher in die Pharmazie können wir an dieser Stelle auch noch machen: Wenn p53 in einer Krebszelle noch funktionsfähig ist, kann es ein starker Mitstreiter bei der Bekämpfung der Krebserkrankung sein. Denn viele Cytostatika wirken, indem sie die DNA von Krebszellen schädigen. Dadurch wird dann p53 aktiviert und führt zum Tod der Krebszelle. Allerdings bedeutet das auch, dass sich Krebserkrankungen, bei denen p53 mutiert ist, mit diesen Cytostatika weniger gut behandeln lassen.

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