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Eine kurze Geschichte der DNA-Sequenzierung: Next Generation Sequencing

Vermutlich habt ihr alle schon einmal vom Human Genome Project gehört. Es war ein großes Projekt mit dem Ziel, das komplette menschliche Erbgut zu sequenzieren. Und das gelang auch – nach etwa 13 Jahren und Kosten von über 2 Milliarden US-Dollar war die menschliche DNA im Grunde genommen vollständig sequenziert (und im Grunde genommen vollständig heißt hier zu etwa 85% vollständig).

Aus heutiger Perspektive wirkt dieser Aufwand geradezu lächerlich. Inzwischen ist es möglich, ein komplettes menschliches Genom in mehreren Stunden bis Tagen und für einige hundert Dollar zu sequenzieren.

Die DNA-Sequenzierung hat also eine ziemlich steile Entwicklung hinter sich. Das sollte wenig verwunderlich sein, denn die eigentlich so „simple“ Aufgabe, die Basenreihenfolge von DNA zu bestimmen, ist aus extrem vielen Wissenschaftszweigen und auch der modernen Medizin nicht mehr wegzudenken. In diesem Beitrag möchte ich diese Entwicklung nachvollziehen und dann die (meiner Meinung nach) spannendsten neuen Entwicklungen vorstellen.

Was ist eine DNA-Sequenz?

Hier möchte ich kurz klären, dass wir alle auf dem gleichen Wissensstand sind, was DNA angeht. Wenn ihr euch also mit dem Aufbau von DNA auskennt, könnt ihr diesen Abschnitt einfach überspringen.

DNA steht für Desoxyribonukleinsäure. Sie besteht aus Nukleotiden, die wiederum aus einer Nukleobase, einem Zuckermolekül namens Desoxyribose und einer Phosphatgruppe aufgebaut sind. Die Basen (A, C, T und G) sind der Teil, der tatsächlich die Information trägt. Die Basenabfolge bestimmt die Funktion des jeweiligen DNA-Abschnitts und wird als die Sequenz der DNA bezeichnet. Wenn ich wissen will, welche Informationen ein DNA-Abschnitt trägt, muss ich die Basenfolge herausfinden, sprich sequenzieren.

Aufbau eines DNA-Strangs. An dem Zucker-Phosphat-Rückgrat hängen die vier Basen Cytosin (C), Guanin (G), Adenin (A) und Thymin (T). Dieser DNA-Abschnitt hätte also die Sequenz CGAT.

Frederick Sanger – Godfather of Sequencing

Frederick Sanger ist einer von nur zwei Menschen, die zwei Chemie-Nobelpreise erhalten haben (zusammen mit K. Barry Sharpless, der den Chemie-Nobelpreis 2022 bekommen hat). Sanger hat beide Preise für Sequenzier-Techniken erhalten. Den ersten Nobelpreis gab es für seine Protein-Sequenzierungen. Unter anderem veröffentlichte er als erstes die Aminosäuresequenz von Insulin. Den zweiten Preis bekam er dann für seine DNA-Sequenzierung.

Frederick Sanger

Diese Sanger-Sequenzierung wird heute noch viel eingesetzt. Der größte Unterschied zu früher ist wohl die Automatisierung. Während damals viel Handarbeit nötig war, laufen der Prozess und die Auswertung inzwischen größtenteils automatisch ab.

Die Sanger-Sequenzierung ist toll. Sonst würde sie auch nicht mehr verwendet werden. Sie hat eine ziemlich kleine Fehlerrate und man kann relativ lange DNA-Sequenzen am Stück sequenzieren (bis zu 1000 bp (bp steht für Basenpaare und ist die typische Einheit, in der die Länge von DNA angegeben wird)). Wenn ich zum Beispiel bei meiner Arbeit ein Gen kloniert habe, und wissen möchte, ob da alles so stimmt, wie ich es mir vorstelle, lasse ich dieses Gen mit Sanger-Sequenzierung sequenzieren. „Meine“ Gene sind relativ kurz, sodass zwei Sequenzier-Läufe normalerweise ausreichen, um die ganze Länge des Gens abzudecken. Und zwei Sanger-Läufe sind auch schnell erledigt, das Ergebnis kommt direkt am nächsten Tag per Mail.

Aber wie man am Human Genome Project sieht, ist die Sequenzierung eines ganzen Genoms mittels Sanger-Sequenzierung ganz schön aufwändig. Wenn man also an mehr als ein paar Sequenzen einzelner Gene interessiert ist, ist man mit einer anderen Technik oftmals gut beraten.

Die nächste Generation

Zur nächsten Generation an Sequenziertechniken, nachvollziehbarerweise next generation sequencing (NGS) genannt, gehört die Illumina Sequenzierung. Für die Sequenzierung von großen Mengen DNA ist das inzwischen die Methode der Wahl. Illumina-Sequencing erlaubt die Sequenzierung von vielen Genen gleichzeitig, was bei großen Probenmengen die benötigte Zeit und den benötigten Aufwand natürlich deutlich reduziert. Für wenige Gene ist und bleibt Sanger jedoch schneller und günstiger.

Über Illumina-Sequenzierung möchte ich aber eigentlich gar nicht so viele Worte verlieren. Es gäbe zwar viel zu erzählen, aber ich möchte mich auf zwei Techniken beschränken, die noch neuer sind. Die werden manchmal third generation sequencing genannt, fallen aber oft auch unter NGS (was, wie ich finde, schon etwas verwirrend sein kann).

Winzig kleine Löcher

Wirklich spannend finde ich die Nanopore-Sequenzierung. Dabei handelt es sich im Prinzip um ein relativ einfaches Konzept, dass es aber tatsächlich erfolgreich umgesetzt wurde ist doch irgendwie beeindruckend.

Der Name verrät schon recht viel. Die Hauptrolle bei dieser Sequenziertechnik spielen nanometer-kleine Poren in einer Membran. Diese Membran teilt eine Kammer in zwei Hälften, in der sich ein Puffer und die DNA befinden. Da die Ionen des Puffers geladen sind, wandern sie durch die Poren in der Membran, wenn eine Spannung an die Kammer angelegt wird. Daraus resultiert ein Ionenstrom, der gemessen werden kann.

Jetzt können allerdings nicht nur die Ionen durch die Membran-Poren wandern, sondern auch die DNA. Und da die Poren nur wenige Nanometer klein sind (also wirklich sehr klein), blockiert sie bei ihrem Durchgang den Weg für viele der wandernden Ionen. Auch das lässt sich wiederum messen, als Abschwächung des Ionenstroms. Das würde jetzt erstmal nicht so viel bringen, so ließe sich ja nur messen, ob überhaupt DNA in der Probe ist. Aber die Basen der DNA sind unterschiedlich groß und blockieren unterschiedlich viel Fläche der Poren, sodass sich aus dem winzigen Unterschied in der Stromstärke die Base ableiten lässt, die gerade durch die Pore geht.

Schematischer Ablauf der Nanopore-Sequenzierung. ssDNA geht durch die Pore und die Veränderung des Ionenstroms wird gemessen. (Bildquelle: DataBase Center for Life Science (DBCLS) – CC BY 4.0)

Wie bei allem gibt es auch bei der Nanopore-Sequenzierung verschiedene Herangehensweisen. Mir als Biochemiker liegt der biologische Weg näher. Dabei werden Transmembranproteine als Poren verwendet, in einer Lipid-Membran. Damit ist das Ganze einer Zellmembran nicht unähnlich. Alternativ kann die Membran auch aus Metall bestehen, und die Poren sind einfache „Löcher“ in der Membran.

Mit dieser Technik lässt sich im Prinzip ein einzelner DNA-Strang sequenzieren, ohne ihn amplifizieren zu müssen. Außerdem lassen sich Geräte, die mit Nanopore-Sequenzierung arbeiten, einfach klein und tragbar gestalten und können Ergebnisse in Echtzeit anzeigen. Zwar ist die Illumina-Sequenzierung noch immer die häufigste Variante, die Nanopore-Sequenzierung hat jedoch das Potenzial, sie abzulösen.

Ein winziges bisschen Licht

Mit ähnlichen Vorteilen kann das single-molecule real-time sequencing (SMRT) aufwarten (wie man bei dem Namen ja irgendwie schon erwarten könnte, mal wieder). Für die Echtzeitsequenzierung werden tatsächlich einzelne Polymerase-Enzyme mit einem einzelnen DNA-Strang kombiniert. Polymerasen sind Enzyme, die DNA vervielfältigen, wofür sie die entsprechenden Nukleotide benötigen. Diese Nukleotide sind bei der Echtzeitsequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen modifiziert, so dass jedes Nukleotid (A, C, T und G) mit einer anderen Wellenlänge leuchtet.

Die Polymerase sitzt in etwas, das sich zero mode waveguide (ZMV) nennt. Wenn jetzt das einzelne DNA-Molekül (übrigens ssDNA) durch die Polymerase vervielfältigt wird, werden nacheinander die fluoreszierenden Nukleotide in den neu entstehenden DNA-Strang eingebaut und leuchten dabei in ihrer jeweiligen Wellenlänge. Bei dem Einbau-Prozess wird das Fluorophor dann allerdings abgespalten, sodass es abdiffundieren kann und das Leuchten aufhört.

Bei dem ZMV handelt es sich um ein wenige Nanometer kleines Loch (jaja, Déjà-Vu, ich weiß). Durch dieses kleine Loch lässt sich das winzige bisschen Licht detektieren, das die fluoreszierenden Nukleotide aussenden (mein physikalisches Wissen reicht aber lange nicht aus, um hier zu erklären wieso das so ist, also müsst ihr mir das jetzt einfach glauben). Aus der Reihenfolge der unterschiedlichen Wellenlängen, die detektiert werden, lässt sich dann auf die Reihenfolge der eingebauten Nukleotide schließen, und die Sequenz der template-DNA ist ermittelt.

Der Physik gehört die Zukunft

Das war mein kleiner Einblick in die Geschichte und Entwicklung der DNA-Sequenzierung. Aber ich habe hier wirklich nur an der Oberfläche gekratzt. Es gäbe noch so viel zu sagen, denn die Entwicklung, die dieses Feld in den letzten Jahrzehnten zurückgelegt hat, ist beeindruckend.

Die Sanger-Sequenzierung war, als sie noch nicht einmal automatisiert war, zwar eine Revolution, aber auch sehr aufwändig. Und heutzutage ist die Sequenzierung eines ganzen Genoms im Stunden-Maßstab überhaupt kein Problem mehr. Und vor allem ist die Sanger-Sequenzierung im Kern noch eine sehr molekularbiologische Methode, während nachfolgende Techniken immer mehr auf physikalischen Prinzipien beruhen. Gerade die dritte Generation mit der SMRT-Technologie, oder die Halbleitersequenzierung, die ich noch nicht erwähnt habe. Auf die Spitze getrieben wird das dann durch die Nanopore-Technik, die komplett ohne Amplifizierung der  DNA auskommt und nur noch auf biophysikalischen Prinzipien beruht. Aber ich schätze mal, zumindest was die DNA-Sequenzierung angeht, gehört der Physik wohl die Zukunft.

Nobelpreis-Spezial: Medizin oder Physiologie 2022

Gestern wurde der Nobelpreisträger in Medizin oder Physiologie 2022 bekanntgegeben. Dieses Jahr geht der Preis an den schwedischen Wissenschaftler Svante Pääbo, der am Max-Planck-Institut für evolutionäre Anthropologie in Leipzig arbeitet. Der Preis wurde verliehen „for his discoveries concerning the genomes of extinct hominins and human evolution”.

In diesem Beitrag möchte ich kurz aufdröseln, was das genau beutet, und was an dieser Forschung so besonders ist.

Das Neandertaler-Genom

Der Kern von Pääbos Arbeit ist eine Frage, die wohl die meisten von uns interessiert: Wo kommen wir her? Denn Svante Pääbo ist Anthropogenetiker und untersucht damit mittels molekulargenetischen Methoden die menschliche Evolution.

Er und seine Arbeitsgruppe waren die ersten, denen es gelang,  DNA aus Fossilien eines Frühmenschen (genauer gesagt eines Neandertalers) zu sequenzieren. Damit erhielten sie zum ersten mal genetische Information über einen früheren Vertreter der Gattung Homo.

Wieso ist das jetzt so besonders? Nun ja, das hat unterschiedliche Gründe. Zum einen ist DNA nicht unendlich stabil, sondern zerfällt mit der Zeit (man sagt, sie degradiert). So ist in einer Probe, die voll mit DNA war, nach tausenden Jahren nicht mehr sonderlich viel davon enthalten, sondern höchstens eine Vielzahl unterschiedlicher Degradationsprodukte. Zum anderen ist die fossile DNA oft kontaminiert. Diese Kontaminationen stammen vor allem modernen Menschen, die mit der Probe umgegangen sind, sowie von Mikroorganismen, welche die Probe besiedeln/besiedelten.

Die erste sequenzierte Neandertaler-DNA stammte aus Mitochondrien (den „Kraftwerken der Zelle“, wie sich sicherlich alle aus dem Bio-Unterricht in der Schule noch erinnern). Von dieser mitochondrialen DNA (mtDNA) sind deutlich mehr Kopien in einer Zelle enthalten als von der chromosomalen (der „normalen“) DNA. Deshalb ist von der mtDNA auch nach tausenden Jahren in einem Knochenstückchen noch mehr erhalten.

Das war zwar ein großartiger Durchbruch, allerdings war die Aussagekraft dieses relativ kleinen Stückchens sequenzierter mtDNA (379 bp) begrenzt. Deshalb machten sich sowohl Pääbos Gruppe als auch andere daran, das Wissen um das Neandertaler-Genom zu erweitern. Die Pyrosequenzierung, eine damals neue Sequenzierungstechnik, ermöglichte es, weitaus effizienter zu arbeiten. Der Vorteil hierbei war, dass die fossile DNA nicht erst mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und Klonierung in Bakterien vermehrt werden musste, sondern „direkt“ sequenziert werden konnte.

Mit der Zeit gelang Pääbos Gruppe es so, das chromosomale Genom eines Neandertalers zu entschlüsseln, und sogar verschiedene Neandertaler-Genome miteinander zu vergleichen.

Eine neue Frühmenschen-Art

Als Pääbo und seine Gruppe die DNA eines weiteren Neandertaler-Fossils analysieren wollten, entdeckten sie etwas erstaunliches: die mtDNA unterschied sich deutlich stärker von der des modernen Menschen als die eines Neandertalers. Damit handelte es sich bei dem Fossil um eine bisher unbekannte Art der Gattung Homo. Anschließend wurde auch hier das chromosomale Genom entschlüsselt.

Die Denisova-Menschen waren enger mit den Neandertalern verwandt als mit Homo sapiens, und der letzte gemeinsame Vorfahre der drei Arten lebte nach Pääbos Erkenntnissen vor etwa 800 000 Jahren. Im Zuge dessen konnte seine Gruppe auch nachweisen, dass das Verbreitungsgebiet der Neandertaler größer war als angenommen, und sich zu einem großen Teil mit dem Verbreitungsgebiet der Denisova-Menschen deckte.Homo

Mit der Entdeckung der Denisova-Menschen wurde das erste mal eine Frühmenschen-Art nur mit genetischen Daten und ohne morphologische Hinweise identifiziert.

Das war 2008, und in den Jahren seither folgten weitere Erkenntnisse zur Genetik von Neandertalern und Denisova-Menschen. Die Gruppe entwickelte fortgeschrittenere Techniken, um fossile DNA zu untersuchen. Sie generierten mehr Daten, um das Genom der Frühmenschen mit dem des modernen Menschen zu vergleichen. Außerdem untersuchten sie die fossile DNA moderner Menschen, die vor 4000 – 45 000 Jahren gelebt haben.

Was wir daraus lernen können

Pääbos Erkenntnisse zur Genetik von Frühmenschen geben tiefe Einblicke in die Evolution des Menschen. So lassen sie unter anderem Erkennen, dass Neandertaler und Denisova-Meschen bereits gemeinsam Eurasien besiedelten, als Homo sapiens Afrika verlassen hat. Wenn sich Neandertaler und moderne Menschen begegneten, muss außerdem eine Kreuzung der beiden Arten stattgefunden haben. Aus Pääbos Daten lässt sich nämlich ableiten, dass 1 – 2% des Genoms von modernen Menschen außerhalb Afrikas von Neandertalern stammen (außerhalb Afrikas deshalb, weil die meisten Begegnungen von Neandertalern und modernen Menschen außerhalb Afrikas stattgefunden haben). Insgesamt finden sich 40% des Neandertaler-Genoms im Homo sapiens-Genom wieder. Außerdem lässt sich zeigen, die Kreuzung regional unterschiedlich stark gewesen sein muss.

Diese Erkenntnisse beruhen (wie das in der Wissenschaft immer so ist) natürlich nicht nur auf Pääbos Funden, sondern werden auch von morphologischen Daten aus den Fossilien gestützt. Pääbo und das – quasi von ihm erfundene – Feld der Paläogenomik haben allerdings einen enorm großen Beitrag dazu geleistet.

Pääbos Gruppe untersuchte außerdem den Einfluss der Frühmenschen-Gene auf die Physiologie des modernen Menschen. Sie konnten diverse Beispiele finden, bei denen ursprünglich aus Frühmenschen stammende Gene unsere Biologie noch heute beeinflussen. Beispielsweise vermittelt ein „Denisova-Gen“ Vorteile beim Leben in großen Höhen.

Das war also meine Zusammenfassung des Nobelpreises für Medizin und Physiologie (Glückwunsch an den Preisträger, falls er das hier jemals lesen sollte). Wenn ihr euch noch genauer informieren wollt, empfehle ich die Advanced Information auf der Website des Nobelpreises.

Außerdem werde ich, sobald die Preisträger verkündet sind, auch den Chemie-Nobelpreis zusammenfassen. Wenn ihr wollt, könnt ihr dort also auch wieder reinlesen.

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